Veiledere:
Arnljot Elgsæter, e-post: Arnljot.Elgsaeter@phys.ntnu.no
Arne Mikkelsen, e-post: Arne.Mikkelsen@phys.ntnu.no

Problemstilling: Mekanismene som ligger til grunn for spektrins biologiske rolle (se kompendium i Molekylær biofysikk) forventes å være knyttet til molekylets fleksibilitet. Testing av alternative teoretiske modeller for spektrins funksjon forutsetter tilgang til kvantitative eksperimentelle data som avhenger av molekylets fleksibilitet. En viktig slik eksperimentell metode er måling av elektrisk indusert dikroisme. Denne metoden er komplementær til måling av dobbeltbrytning (se kompendium i Molekylær biofysikk), men vil ofte gi mer kvantitative eksperimentelle data. Et topp moderne og unikt oppsett for slike målinger er nå under fullføring innen gruppe for biopolymere (dr.stipendiat Stine Nalum Næss) og forventes å være ferdig i god til før høsten 2000.

Diplomoppgave: Spektrin forekommer i cellemembranen hovedsakelig som tetramerer. Tolkning av eksperimentelle data fra slik multimerer er mye vanskeligere enn tolkning av data fra enkeltkjeder. Inntil for kort tid siden var det ikke kjent hvordan man kunne isolere spektrin-enkeltkjeder. Tidsmessig vil den tilbudte diplomoppgaven i hovedsak omfatte isolering, rengjøring og karakterisering av spektrin-enkeltkjeder, dvs. bruk av standard metoder innen proteinkjemi som ultrasentrifugering, gelfiltrering og SDS-elektroforese. I samband med bruk av den nye elektrooptiske instrumenteringa vil man få den assistanse man ønsker av Stine.

Veileder: Bjørn T.Stokke, e-mail: Bjorn.Stokke@phys.ntnu.no

Scleroglukan er et langkjedet polysakkarid som danner en trippel-heliksstruktur i vandig løsning. Det er stor interesse for slike b (1,3)-glukaner på grunn av deres immunstimmulerende evne. Det er velkjent hvilke løsningsmiddelbetingelser som kan brukes for å dissosiere trippel-heliks strukturen. Det er imidlertid vanskelig å utlede stabiliteten til trippel-heliksen ut fra betingelsene som skal til for å dissosiere denne. I denne oppgaven planlegges det å bestemme kraft-strekke relasjoner til enkeltmolekyler, og geler av scleroglukan. Målsettingen med å bestemme kraft-strekke relasjoner til enkeltmolekyler er todelt. For det første, det reversible område av kraft-deformasjons-kurven vil gi fundamental informasjon om kjedestivhet til denne type strukturer. For det andre, forventes det at de kreftene som holder trippel-heliksen sammen vil destabiliseres tilstrekkelig til å endre på lokal struktur ved økende forlengelse, og til slutt føre til delvis eller fullstendig dissosiering av trippel-heliksen. Dette planlegges ved at scleroglukan bindes både til et underlag (glimmer) og til AFM-spissen ved hjelp av to ulike, spesifikke mekanismer (for å unngå løkkedannelse).

Scleroglukan kan også kryssbindes til nettverk. Det er etablert flere metoder for dette. Det er videre velkjent hvilke løsningsmiddelbetingelser som skal til for å føre til makroskopisk kollaps av disse gelene. Underliggende endringer i lokal struktur som gir slik endring i makroskopisk likevektsvolum er ikke kjent for slike relativt stive polymerkjeder. Det planlegges derfor å fremstille scleroglukan geler under kontrollerte betingelser og å bestemme stukturen til disse ved hjelp av AFM under betingelser som svarer til ulike makroskopiske faser. I tillegg til direkte bildeanalyse planlegges det også å se på autokorrelasjon g(r) i høydevariasjonene.

AFM (Atomic force mikroskop) teknikken er kort beskrevet i andre tilbud om diplomoppgaver, og det henvises til denne beskrivelsen.

Aktuelle problemstillinger:

• Enkeltmolekyl kraft spektroskopi av scleroglukan med veldefinert kjedelengde og interne brudd i enkeltkjedene.
• Kvantisering av bindingsenergien til scleroglukan trippel-heliks struktur ved hjelp av elastisk koplet modell for strekkbarhet i biopolymerer.
• Topografisk kartlegging av elastisitet til scleroglukangeler og porestørrelsesfordeling til scleroglukangeler.
• Bestemmelse av autokorrelasjoner i høydevariasjon til sclerglukangeler og hvordan decay i autokorrelasjonsfunksjonene avhenger av svelletilstand og andre gelingsparametre (konsentrasjon, kryssbindingstetthet) til scleroglukangeler.

Veiledere:
Bjørn Torger Stokke, Gruppe for biopolymerer, Inst. for fysikk, FIM, NTNU
Gudmund Skjåk-Bræk, Inst. for bioteknologi, KB, NTNU

Molekylære motorer er velkjent fra cellebiologien, f.eks kinesiner eller dyneiner, hvor deres biologiske funksjon er knyttet til deres evne til å bevege seg langs cytoskjelettet. C5-mannuronan epimeraser er involvert i biosyntesen til alginat. Alginater er en familie strukturelle polysakkarider som danne geler avhengig av innhold og sekvens de to enhetene (a -L-guluronsyre, og b -D-mannuronsyre) i ko-polymeren. De forekommer naturlig med ulike relativt innhold og sekvens av de to enhetene. Biosyntesen av alginat viser at disse polymeriseres i utgangspunktet som langkjedede hompolymerer av b -D-mannuronsyre. Den andre komponenten i alginat, (a -L-guluronsyre) blir introdusert ved at enzymer av typen C5-epimerase omsetter b -D-mannuronsyre til a -L-guluronsyre internt i polymeren. Det er i dag fremstilte flere C5-epimeraser ved hjelp av genteknologi. Disse introduserer ulike sekvensmønster (som kan bestemmes ved NMR) når de virker på alginatmolekylene. Bruk av epimeraser som gir ulike sekvensmønster og forskjellig omsetningsgrad gjør oss i stand til å kunne kontrollere sekvensmønster til alginatmolekylene som langt overgår det som er naturlig forekommende.

De observerte sekvensmønster som ulike epimeraser introduserer kan ikke forklares ved at de utfører et angrep på et tilfeldig valgt sted langs polymerkjeden, omsetter b -D-mannuronsyre til a -L-guluronsyre, dissosierer, og ufører et nytt angrep på tilsvarende måte. En mulig modell for mekanismen er at noen epimeraser er molekylære motorer og glir langs polymerkjeden etter hvert som epimeriseringen foregår. Kartlegging av disse aspekter av enzymmekanismen er avgjørende for forståelsen av sekvensen til alginat. Gelingsegenskapene til alginat er knyttet til mengde og sekvens av de to sukkerenhetene, og en kan ved bruk av de rekombinante epimerasene kontrollere gelegenskapene (styrke, porestørrelsesfordeling, lekkasje) for en gitt anvendelse. Alginatgeler brukes blant annet til å lage en immunbeskyttende kapsel rundt langerhans øyer når de skal transplanteres (for behandling av sukkersyke).

Hovedverktøyet som planlegges brukt i dette arbeidet er atomic force mikroskop (AFM). Dette er en relativt ny eksperimentell teknikk som tillater direkte avbildning av (bio)polymerer, aggregater av disse, celler, osv., uten å fjerne vann. Detaljer i sub-nm området er i prinsippet mulig å oppnå. Ved sekvensiell avbildning kan en i tillegg få frem dynamiske aspekter. AFM teknikken kan også brukes til topografisk kartlegging av elastisitet med oppløsning ned mot nm-området og måling av krefter assosiert med spesifikke vekselvirkninger som f.eks. alginat og rekombinante C5-epimeraser ved bruk av kontrollert preparering av AFM nålespissen.

Målsettinger

• Bestemmelse av bindingsenergier mellom rekombinante C5-epimeraser og ulike alginatsubstrater.
• Kartlegging av virkningsmekanismer til rekombinante C5-epimeraser på alginatsubstrater ved sekvensiell avbildning ved hjelp av AFM.
• Bestemmelse av alginat struktur og topografisk kartlegging av gel-elastisitet til alginater modifisert ved hjelp av rekombinante C5-epimeraser.

Veiledere:
Bjørn Torger Stokke, Gruppe for biopolymerer, Inst. for fysikk, FIM, NTNU
Kjell M.Vårum, Inst. for bioteknologi, KB, NTNU

Transport av DNA over cellemembranen viser seg å være en praktisk begrensning i forbindelse med genterapi. En måte å prøve å løse dette på har vært å innkapsle DNA (med ønsket sekvens) i miceller for deretter å la disse micellene smelte sammen med membranen. Dette gjør det mulig å få til en lettere transport av DNA over membranen. En annen effektiv måte har i det siste vist seg å være kompleksering av DNA med ulike polykation. Kompleksering av DNA med polykationer viser seg å kondensere den utstrakte dobbelheliks strukturen til en toroidal struktur. Ulike polykationer komplekser DNA med ulike effektivitet, og også på en måte som polykationspesifikt kan forhindre videre aggregering av toroidale polykation-DNA komplekser. Evnen ulike polykation –DNA komplekser har til å få DNA transportert over membranen er rapportert til å være sterkt knyttet til den videre størrelsen av den toroidale, kondenserte formen, og fravær av videre aggregeringen av disse strukturene. En tilleggsfaktor er at ulike syntetiske polykationer kan ha andre uønskede effekter (toksisitet).

I denne oppgaven vil vi ta for oss kitosan som isolert sett har en rekke fortrinn framfor de syntetiske polykationene i biologiske anvendelser, og studere i hvilken grad vi kan danne komplekser av DNA i en toroidal form som ikke aggregerer videre ved hjelp av kitosan. Kitosan fremstilles fra kitin som er et strukturpolysakkarid i reke- og krabbeskall. Ulike kvaliteter av kitosan (molekylvekt, ladningstetthet, motioner) vil kunne brukes i oppgaven. Kitosan er velkjent med hensyn til hvilken immunologisk respons det induserer. Videre, det er velkjent hvordan ulike kitosaner brytes ned ved et naturlig forekommende mammalsk enzym (lysozym). Således har kitosan fortrinn framfor syntetiske polykationer i biologiske anvendelser. Effektiviteten til kitosan til å danne toroidale komplekser med DNA er lite kjent. I denne oppgaven vil vi se på hvordan kitosaner av ulike kvaliteter komplekserer DNA, både med hensyn til struktur til det endelig supramolekylære komplekset, og om mulig, tidsutvikling av dannelsen av toroidale komplekser.

Hovedteknikken som planlegges brukt i oppgaven er Atomic force mikroskop (AFM). Dette er en relativt ny eksperimentell teknikk som tillater direkte avbilding av (bio)polymerer, aggregater av disse, celler, osv., uten å fjerne vann, med en oppløsning i sub-nm området. Teknikken tenkes primært brukt i denne oppgaven for avbildningsformål, men det er også mulig å bestemme topografisk fordeling av elastisitet til f.eks. celler, eller kvantiserting av spesifikke vekselvirkninger.

Aktuelle problemstillinger:

• Kontroll og kartlegging av struktur til kitosaner og DNA ved hjelp av AFM.
• Effekt av prepareringsbetingelser, molekylvekt og ladningstetthet av kitosan på deres evne til indusere toroidale supramolekylære strukturer i DNA kartlagt ved AFM
• Kvantitative bestemmelse av toroidale kitosan-DNA strukturer ved bildebehandling.
• Teorertisk analyse av polyelektrolytt induserte toroidale strukturer i DNA.